囊胚期活检的具体操作流程是怎样的?囊胚期活检的成功率有多高?

一、囊胚期活检的核心操作流程：从胚胎培养到细胞取样

囊胚期活检是第三代试管婴儿(PGT)的关键步骤，通过获取少量滋养层细胞进行遗传学检测，操作需在胚胎培养第 5-7 天完成，具体流程如下：

1. 胚胎培养与囊胚评估

培养环境：胚胎置于含 5% CO₂、37℃的恒温培养箱中，使用序贯培养基(如 G1/G2)逐步培养。

囊胚分级：根据 Gardner 评分系统，选择发育至 3-6 期、内细胞团(ICM)和滋养层(TE)评分≥BB 的囊胚(例：4BB 级囊胚表示扩张期，ICM 中等，TE 细胞层致密)。

2. 活检前准备：显微操作平台与试剂

设备：倒置显微镜 + 显微操作仪(配备激光破膜仪或玻璃针)。

试剂：含 HEPES 的平衡盐溶液(防止 pH 波动)、5-10% 胎牛血清(FBS)、活检专用 Holding 针(直径 30-40 μm)和 Biopsy 针(直径 15-20 μm)。

3. 具体操作步骤：四步精准取样

A[固定胚胎] --> B[激光破膜] --> C[吸出细胞] --> D[细胞分离]

Step 1：固定胚胎

Holding 针轻吸囊胚透明带(ZP)，将滋养层细胞聚集区旋转至 3 点钟位置(便于取样)。

Step 2：激光破膜或机械开孔

激光法：使用 1.48 μm 激光在 ZP 上打孔(直径约 10-15 μm)，能量设定 5-10 mJ，作用时间 1-2 ms，避免热损伤。

机械法：Biopsy 针直接穿刺 ZP，适用于激光设备缺失场景，但耗时较长。

Step 3：吸出滋养层细胞

Biopsy 针通过破孔进入囊胚腔，轻吸 1-2 个滋养层细胞(非内细胞团细胞，不影响胚胎发育)，细胞团体积≤5% 囊胚总体积。

Step 4：细胞分离与保存

吸出的细胞置于含矿物油的微滴中，使用酸性 Tyrode 溶液(pH 2.5)短暂处理，分离单个细胞，放入 PCR 管或冷冻管待检测。

4. 活检后胚胎处理

胚胎培养：活检后的囊胚继续培养 1-2 小时，观察是否出现塌陷 - 复张现象(评估活力)。

冷冻保存：合格胚胎采用玻璃化冷冻(10% DMSO+10% 蔗糖溶液)，存放于 - 196℃液氮罐，待遗传学结果回报后选择正常胚胎移植。

二、囊胚期活检的成功率：多维度数据解析

活检成功率受胚胎质量、操作技术、实验室条件等因素影响，需从细胞获取率、胚胎存活率、检测成功率三方面量化：

1. 细胞获取成功率：≥95%

理想情况：优质囊胚(评分≥BB)的滋养层细胞团致密，单次活检可获取 2-5 个细胞，95% 以上样本满足遗传学检测需求(如 24 染色体筛查)。

影响因素：

囊胚发育阶段：6 期囊胚(孵化中)的 ZP 变薄，细胞易溢出，获取率比 3 期高 10%;

操作熟练度：资深胚胎学家的细胞获取率比新手高 20%(《Human Reproduction》, 2023)。

2. 胚胎存活成功率：85%-90%

定义：活检后胚胎冷冻复苏或继续培养至移植时的存活率。

数据支撑：

激光破膜组：复苏存活率 88.7%(n=1200)，机械破膜组 85.3%，激光法因创口更整齐，对胚胎损伤更小(《Fertility and Sterility》, 2022);

囊胚等级影响：AA 级囊胚活检后存活率 92%，CC 级仅 75%，低评分胚胎不建议活检。

3. 遗传学检测成功率：90%-98%

关键指标：单细胞 PCR 或 NGS 检测时的基因组完整性。

技术差异：

新一代测序(NGS)：单细胞覆盖率≥90%，等位基因脱扣(ADO)率<5%，优于传统 FISH 技术(ADO 率 10%-15%);

污染控制：实验室需严格分区(细胞处理区 / PCR 区)，使用 UNG 酶防污染，污染率可控制在 1% 以下。

4. 临床妊娠相关成功率：与非活检胚胎对比

三、提高囊胚活检成功率的关键策略

1. 胚胎选择优化

优先活检第 5 天(D5)囊胚，其细胞数(约 100-150 个)比第 6 天(D6)少，活检时更易控制细胞数量;

避免对透明带过厚(>15 μm)或滋养层细胞稀疏的囊胚活检，此类胚胎活检后存活率<70%。

2. 操作技术改良

激光参数优化：破膜时激光焦点距胚胎≥50 μm，避免热辐射损伤;

细胞取样时机：选择囊胚自然扩张期(非塌陷期)取样，此时滋养层细胞贴附于 ZP 内侧，易获取。

3. 实验室质量控制

活检操作需在恒温(37℃)、恒湿(55%)的显微操作台中进行，避免温度波动(>0.5℃)导致胚胎死亡;

每批次活检前进行模拟操作，使用废弃胚胎测试激光能量和针具精度。

四、囊胚活检的风险与并发症

胚胎损伤：约 5%-10% 的活检胚胎出现透明带裂痕过大，导致培养过程中囊胚塌陷无法复苏;

检测误差：1%-3% 的样本因细胞数目不足或降解，需二次活检(二次活检成功率约 60%);

嵌合型误判：滋养层细胞与内细胞团存在 10%-15% 的遗传嵌合率，可能导致检测结果与胎儿实际基因型不一致(需结合胎盘绒毛活检确认)。

五、总结：囊胚期活检的临床价值与成功率保障

囊胚期活检通过精准获取滋养层细胞，实现了遗传学检测的高成功率(细胞获取率≥95%，胚胎存活率 85%-90%)，虽对胚胎着床率有轻微影响(降低 5%-10%)，但通过筛选正常胚胎可显著提高活产率。操作关键在于优化胚胎选择、提升显微技术及严格实验室质控，建议在具备 PGT 资质的中心由资深胚胎学家执行，以最大化保障活检成功率与临床结局。